<< Предыдушая Следующая >>

Индукция реверсии раковых клеток в нормальные – путь их ликвидации

Термин «реверсия» (от лат. reversio – возврат). Этим термином обозначают:

- возврат свойств раковой клетки к норме или возврат ее к нормальной клетке;

- утрата раковой клеткой злокачественности;

- созревание раковой клетки до нормально дифференцированной клетки и другое (И.Н. Швембергер, 1976, 1980).

До сих пор причиной канцерогенеза считали изменения структуры генов и аберрации хромосом в клетке; а такие изменения в принципе не обратимы. Из этого был сделан вывод: раковую клетку нельзя превратить в нормальную клетку.

Это одна из причин того, что до сих пор все методы лечения рака – для удаления и уничтожения раковых клеток.

Но есть в литературе примеры спонтанной реверсии раковых клеток, хотя и очень редкие, и множество экспериментов, доказавших, что раковые клетки можно вернуть к нормальному состоянию.

При введении генов-супрессоров в раковые клетки in vitro наблюдалась реверсия раковых клеток:

- клетки остеосаркомы имели мутации в гене Rb1; введение кДНК нормального гена Rb1 в эти клетки в культуре вызывало их реверсию;

- в раковые клетки также в культуре вводился нормальный ген wt53; под его действием раковые клетки теряли свойства ракового фенотипа. Из работы не ясно, насколько стабильна реверсия раковых клеток в этих опытах (Н.Б. Варшавер, 2000).

T.J. King, R.G. McKinnell (1960) выделили из клетки кератокарциномы почки лягушки ядро и пересадили в оплодотворенную и энуклеированную яй цеклетку лягушки – развились нормальные лягушки. Из этих опытов ученые сделали два вывода: 1) ядро яйцеклетки может быть заменено ядром раковой клетки; 2) ядро раковой клетки, участвуя в эмбриогенезе, теряет раковые свойства. Недостаток опытов этих авторов: в них нет данных, что генетический материал раковой клетки был нормальным.

В. Минтц (В. Mintz, 1978) проведены опыты на мышах. В бластоцисты вводили по нескольку раковых клеток из тератокарциномы мыши. Получено нормальное потомство, ткани их были сформированы клетками донора и клетками хозяина. Нормальные потомки могли вырасти только в том случае, если раковые клетки испытали обратное превращение, т.е. в опытах показана реверсия раковых клеток в нормальные клетки. Позже при анализе кариотипа перевивных раковых клеток оказалось, что все они были анеуплоидными.

Так было доказано, что причина канцерогенеза – не мутации генов и/или аберрации хромосом, а эпигенетические изменения. Это изменения экспрессии генов: включение генов или их выключение, но без изменения их структуры. В отличие от мутаций, эпигенетические изменения генов обратимы. Это указывает на новый способ ликвидации раковых клеток – их реверсию.

Если причина – мутация гена, тогда воздействовать на него можно только генетически, что не просто. Но так как причина канцерогенеза – эпигенетическое изменение гена, то его можно исправить: ген можно включать и выключать.

Эпигенетические изменения чаще всего осуществляются обратимой химической модификацией в промоторе гена: удаление метильной группы (-CH3) – ген включен, присоединение метильной группы (-CH3) – ген выключен.

Включение гена или его экспрессия означает синтез в клетке иРНК – это транскрипция, а затем синтез по ней белка в рибосоме – трансляция. При этом субстратом метильных групп является цитозин (C). Цитозин метилируется лишь тогда, когда за ним в одной цепи ДНК следует гуанин, т.е. СpG, где p – остаток фосфорной кислоты (В.А. Гвоздев, 1999).

Различают два типа распределения дуплетов CpG в ДНК: они рассеянные и одиночные или в виде скоплений и тогда их называют CpG-островками.

Метилирование цитозина осуществляет фермент метилтрансфераза, а деметилирование – фермент деметилаза. Присоединение метильной группы (- CH3) к пятому атому углерода на место атома водорода превращает его в 5- метилцитозин. Метильная группа (-CH3) – это регулятор включения или выключения гена в клетке. Это изменяет состав белков в дочерних клетках, и тем самым изменяются свойства клеток. При делении клетки метильные группы передаются клеткам-потомкам, а, значит, в них сохраняется такой же набор включенных и выключенных генов, что и в материнской клетке.

Перед репликацией ДНК ее цепи расходятся, и каждая цепь сохраняет свои метильные группы. Ясно, что после репликации две дочерние молекулы получаются полуметилированными. Но их сразу же метилирует метилтрансфераза в тех местах, где в исходной цепи есть метильные группы.

Если исходная ДНК не метилирована, то и дочерние молекулы будут такими же, так как метилтрансфераза действует только на полуметилированных молекулах ДНК.

Наличие или отсутствие метильных групп является сигналом для белков транскрипции. Включение гена начинается с того, что белок транскрипции узнает специфическую последовательность в промоторе гена и связывается с ним. Лишь после этого РНК-полимераза начинает синтез иРНК, она комплементарна кодирующей цепи гена.

Дело в том, что РНК-полимераза сама по себе не узнает последовательность нуклеотидов в промоторе гена, а значит, сама не может соединиться с ним (Р. Холлидей, 1989; В.А. Гвоздев, 1999) (Рис.1).

Рис. 1.

Белок транскрипции связывается с последовательностью нуклеотидов, и РНК-полимераза синтезирует иРНК



(рис. и цит. по: Р. Холлидей,1989).

В результате метилирования CpG-динуклеотидов в промоторе ген выключается, т.е. репрессируется. Это может иметь две причины: метильные группы препятствуют связыванию белка транскрипции с промотором гена или способствуют присоединению репрессора (Рис. 2).

Рис. 2.

Присоединение метильных групп -СН3 к цитозину в составе CpG- динуклеотида

. Связывания белка транскрипции с промотором гена не происхо- дит, и ген выключается (рис. и цит. по: Р. Холлидей, 1989) .

У. Гиббс (2004) подчеркивает, что для раковой клетки характерны: снижение метилирования ее генома в целом и повышение содержания метильных групп в генах-супрессорах, препятствующих превращению нормальной клетки в раковую клетку.

До недавнего времени, продолжает автор, «многие ученые полагали, что канцерогенез начинается с мутации, выводящей из строя гены-супрессоры. Однако во многих раковых клетках эти гены не содержат никаких изменений в нуклеотидной последовательности» (У. Гиббс, 2004).

В настоящее время клиницисты уже проводят тестирование препаратов против избыточного количества метильных групп (-CH3) в раковой клетке. Такие лекарства должны обеспечивать: либо «отщепление метильных групп от генов, либо препятствовать их присоединению в новых клетках». Такие препараты перспективны, – считает С. Майер (S. Maier). Она же работает над созданием методов диагностики раковых клеток на основе метилирования их генов.

Но, по мнению С. Майер, существует одна проблема: «Все такие препараты деметилируют геном в целом, т.е. не избирательно, что приводит к побочным эффектам». Другой проблемой «для беспокойства является – нестабильность действия: вскоре метильные группы (-CH3) появляются снова, и гены- супрессоры в раковой клетке выключаются».

«Изменение экспрессии генов под влиянием лекарств носит временный характер», – считает Ж.-П. Исса (Jean-Pierre Issa). – Но если изменение будет таким, что иммунная система организма сможет распознавать раковые клетки, или если оно включит процесс апоптоза, то результат так или иначе будет достигнут».

G. Fichera (1932) впервые для реверсии раковых клеток использовал экстракты эмбриональных тканей, а теперь из них выделяют фетальные белки – альфа-фетопротеин и другие.

Понимание этого вызывает интерес к изучению взаимодействия раковых клеток с эмбриональными клетками и тканями. Это открывает пути к индукции реверсии раковых клеток в нормальные клетки.

Во многих странах исследования ведутся по трем направлениям:

- культивирование раковых клеток в присутствии эмбриональных клеток и экстрактов;

- введение раковых клеток в сингенные эмбрионы;

- введение эмбриональных экстрактов или эмбриональных белков в раковую опухоль, а также и внутримышечно в организм.

Д-р Линне-Мари Постовит и ее группа (2005) из США показали, как микросреда эмбриональных стволовых клеток человека стимулирует реверсию метастатических клеток меланомы в нормальные клетки.

Они создали трехмерную коллагеновую матрицу, которую предварительно заселяли эмбриональными стволовыми клетками человека и давали им несколько дней на формирование колоний и подготовку микросреды. Затем эти клетки удаляли, а микросреда оставалась в матрицах нетронутой. Потом микросреду матриц засевали клетками меланомы и оставляли на несколько дней, а затем проводили молекулярный и функциональный анализ.

Результаты: у клеток меланомы изменялась программа, и они начинали секретировать протеин Melan-A, связанный с меланоцитами, и образовывать колонии, подобные колониям эмбриональных стволовых клеток человека. Клетки становились менее инвазивными, чем меланомные клетки, не испытавшие на себе воздействие этих матриц.

Ученые подчеркивают, что «эти результаты дают новый подход к изучению возможных последствий выявления факторов микросреды, созданной человеческими эмбриональными стволовыми клетками, которые влияют на обращение метастатических свойств опухолевых клеток».

Известно, что в составе клеток рака часть клеток имеет признаки дифференцировки. Поэтому возникло предположение, что с появлением их диффе ренцировки, злокачественность раковых клеток должна снижаться (G.B. Pirce, 1970; G.B. Pierce, L.D. Jonson, 1971; G.B. Pierce, 1972; И.Н. Швембергер, 1978,1980).

G.B. Pierce, G. Wallace (1971) изучали роль дифференцировки в реверсии раковых клеток. Крысам делали прививки клеток из ороговевающего рака и изучали методом авторадиографического анализа.

Через 2 ч после введения Н-тимидина мечеными были только недифференцированные участки рака, а уже через 96 ч клетки, связавшие Н-тимидин, обнаруживались в дифференцированных участках рака в составе «раковых жемчужин».

Выделение раковых клеток из дифференцированного участка и попытка прививки их животным – не вызывала рак, тогда как такое же количество клеток из недифференцированного участка – давало рост рака.
Из этого ясен вывод: дифференцировка раковых клеток приводит к утрате у них злокачествен- ных свойств и превращает их в нормальные клетки. Известно, что дифференцированная клетка после выполнения функций прекращает делиться и погибает через апоптоз. Это путь ликвидации раковых клеток не методами уничтожения их, а через их реверсию в нормальные клетки (Л. Сакс, 1986; В.А. Галицкий,2003).

А.П. Савоновская (1952) вводила по 10 млн. клеток первичной саркомы Уокера крыс в крысиные эмбрионы, находящиеся на ранних стадиях развития. Оказалось, что клетки, введенные в эмбрионы в течение первых двух третей беременности, не вызывали рак, а введенные в последнюю треть дали рост саркомы на эмбрионах.

Эти опыты показали, что при введении раковых клеток в эмбрионы раннего периода они подвергаются воздействию какого-то фактора и происходит их реверсия в нормальные клетки. В последнюю треть срока этого фактора нет – нет и реверсии клеток саркомы.

Из исследований Л. Сакс (1986) и В.А. Галицкого (2003) следует, что фактором реверсии в приведенном опыте мог быть фактор роста, к которому на раковой клетке обычно сохраняется рецептор. Связывание фактора роста с рецептором на раковой клетке включает в ней ген дифференцировки, и она превращается в дифференцированную нормальную клетку, а вместе с этим утрачивает все свойства раковой клетки.

W.E. Poel (1964) провел анализ всех типов канцерогенеза. По его мнению, «во всех этих случаях нет доказательств, что канцерогены действуют и вызывают необратимые изменения в тех клетках, которые претерпевают злокачественное перерождение, но все они прямо или косвенно вызывают нарушения регуляции размножения клеток, т.е. эпигенетические изменения».

Канцероген является «веществом, которое способно изменять характер репрессии генов – веществом, способным «снимать» -CH3–группы, экранирующие промотор гена и тем самым вызывать дерепрессию определенных генов в клетке.

Дж. Пирс (G.B. Pierce, 1972) на основе анализа ряда эмбриональных и неэмбриональных раков разного типа клетки предложил схему канцерогенеза.

В основе канцерогенеза, по мнению Дж. Пирса, лежит воздействие на клетку-мишень канцерогена, что вызывает эпигенетические изменения в ее определенных генах – включение одних генов и выключение других: нормальная стволовая клетка – раковая стволовая клетка, а из нее образуется раковая стволовая клетка и нормальная дифференцированная клетка.

Такая концепция канцерогенеза, с точки зрения Дж. Пирса, «объясняет безнадежность борьбы с раком с помощью цитотоксических веществ, а указывает иной путь – направленное изменение экспрессии генов и реверсию раковых клеток в нормальное состояние».

Для этой цели во многих странах и в нашей стране готовят препараты из эмбриональных и плацентарных тканей человека.

1. С.Ю. Родионов и соавторы (1995) применили экстракт из фетальных тканей человека для лечения инкурабельных пациентов IV клинической группы с различными типами рака.

Основаниями для этого служили: появление на поверхности раковых клеток и в сыворотке крови пациента фетальных антигенов, в норме обнаруживаемых только в тканях эмбрионов.

Однако, иммуногенность белков-антигенов на поверхности раковых клеток мала. Одной из причин этого является экранирование антигенов антителами. Основным из них на раковой стволовой клетке любого типа является фетальный белок под кодовым обозначением – «5Т4».

Авторы считают, что введение экстрактов фетальных тканей «снимает» с поверхности раковых клеток антитела и открывает эпитопы антигенов для узнавания клетками иммунной системы пациента.

Исследования эмбриональных фетальных тканей в опытах на животных по стандартной схеме доклинических испытаний, показали отсутствие токсического действия на организм, способность стимулировать клеточную иммунную реакцию и фагоцитоз.

Авторы провели лечение пациентов экстрактом из фетальных тканей человека и получили результаты: из 39 пациентов, страдающих от рака, применение таких препаратов дало эффект у 20 (51,2%), а сроки ремиссии от 2 мес. до 4 лет.

2. Д-р С. Пеленгарис (S. Pelengaris, 2002) и ее группа из Глазго (Англия), а также проф. Д. Фелшер (D. Felsher, 2002) из США изучили роль гена с-myc в возникновении раковой клетки из нормальной клетки в культуре и в опытах на мышах. На основании результатов исследований авторы заключили:

- «представление, что для канцерогенеза необходимо множество мутаций в нормальной клетке, неверно»;

- «причиной возникновения раковой клетки может быть всего один ген и его продукт, известный как – c-Myc. Именно в нарушении регуляции его экспрессии на фоне нарушений в апоптозе ученые видят причину образования раковой клетки».

Эти же ученые из Глазго с коллегами из Сиэтла, США (2002), нашли способ «выключать» ген c-myc, «делающий раковые клетки смертельными».

Оказалось, что известный антибиотик доксициклин останавливает деление раковых клеток.

На мышах был поставлен опыт с генетически модифицированными клетками печени: до тех пор, пока животным добавляли в корм доксициклин, рак у них не возникал. Когда антибиотик давать прекращали, у них опять начинался рак этого органа. После того, как мышей снова «посадили» на антибиотик, у них началась стремительная ремиссия: рак исчез, а клетки печени не проявляли никаких отклонений от нормы. То есть ученые смогли по своему желанию

«включать» и «выключать» опасный ген, вызывающий рак.

Авторы пишут, что в странах мира «рак поражает каждого третьего человека и убивает каждого пятого». «Теперь выявлено лекарство, которое может блокировать раковые клетки». Но «интересно уже то, что раковые клетки можно преобразовывать обратно в нормальные», заключают ученые.

3. «Вакцинация эмбриональными стволовыми клетками предотвращает рак у мышей», – так называется статья ученых университета Луизианы (США), работающих под руководством проф. Джона Итона (John Eaton, 2006).

Ученые показали, что вакцинация эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) предотвращает рак легких у мышей, подвергающихся воздействию канцерогенных веществ или трансплантации раковых клеток.

Было обнаружено, что вакцинация ЭСК предотвращает рак с эффективностью 80-100% в случае прививки клеток карциномы Льюиса и 60-90% в случае воздействия канцерогенов.

Ученые проверяли два типа вакцин против раковых клеток. Один тип состоял только из ЭСК, взятых из мышиных бластоцист. Другой тип – из этих же ЭСК в комбинации с фибробластами, синтезирующими гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор роста (GM-CSF). Такие фибробласты (STO) используют в качестве фидера – питающей подложки, на котором выращивают ЭСК, что поддерживает ЭСК в недифференцированном состоянии.

Этапы эксперимента. На первом этапе – мышам делали инъекции одной или другой вакцины, на втором этапе – одним мышам трансплантировали клетки карциномы легких Льюиса, а на других мышей воздействовали веществом –

3-метилхолантрен, вызывающим рак легких.

Результаты. В случае заражения клетками карциномы ЭСК предотвращали рост рака в 80% случаев, а ЭСК в сочетании c STO/GM-CSF – в 100% случаев.

При воздействии канцерогена первый тип вакцины действовал с 60% эффективностью, а второй – 90%. В течение 27 недель наблюдения у соответствующего процента мышей не развивались опухоли. У тех вакцинированных мышей, у которых опухоли все-таки выросли, размер их был на 80 – 90% меньше, чем у невакцинированных животных. Опухоли развились у всех без исключения мышей контрольной группы, которым не проводили вакцинацию, как в результате трансплантации клеток карциномы, так и в результате воздействия канцерогена. Ни у одной из вакцинированных мышей не наблюдалось побочных эффектов – аутоиммунная реакция или угнетение стволовых клеток костного мозга.

«Ученые считают, что предотвращение вызванного канцерогенами рака – более важный результат их работы, так как эта модель ближе к реальной жизни, чем трансплантация раковых клеток». Этот эффект вакцинации эмбриональными стволовыми клетками ученые объясняют тем, что стволовые и раковые клетки вырабатывают ряд сходных белков. Вакцинация приводит к выработке иммунитета против раковых клеток, содержащих эти белки.

На наш взгляд, основной причиной эффекта с помощью этой вакцины могла быть индукция реверсии раковых клеток, что продемонстрировано в опытах с клетками меланомы in vitro в микросреде от эмбриональных стволовых клеток человека Л.-М. Постовит (2005).

Открытие ученых позволяет им надеяться на разработку клеточных вакцин для людей с повышенным риском рака или подвергающихся воздействию канцерогенов.

Тестировать новую противораковую вакцину на людях ученые считают преждевременным из-за возможных побочных эффектов. Не исключено, что такая вакцинация может вызывать реакцию клеток иммунной системы на собственные стволовые клетки организма. Но проф. Джон Итон полагает, что «дальнейшее совершенствование метода позволит избежать этого риска».

В настоящее время он и его группа изучают возможности предотвращения при помощи своих вакцин различных типов рака, вызванных канцерогенами, а также «вакцинируют старых животных, чтобы предупредить гормонально-зависимые опухоли, которые обычно развиваются у многих из них».

Материалы исследования были доложены на международном онкологическом симпозиуме EORTC–NCI–AACR в Праге (2006).
<< Предыдушая Следующая >>
= Перейти к содержанию учебника =

Индукция реверсии раковых клеток в нормальные – путь их ликвидации

  1. Реверсия раковых клеток
    Реверсия раковых
  2. Нарушения в передаче сигнала к делению в раковой клетке: но- вые мишени для уничтожения раковых клеток
    Стандартные лекарства против раковых клеток действуют на них через повреждения их ДНК. Но при этом такое же действие их и на здоровые клетки организма пациента. То есть эти лекарства неизбирательные, с тяжелыми побочными эффектами. Для избежания этого, ученые долго искали новые мишени для лекарств, чтобы уничтожать только раковые клетки. Их нашли в «участниках» передачи сигнала к делению в
  3. Вакцина на основе дендритных клеток для поиска и уничтожения раковых клеток
    Даже солидный рак с размера узелка 2 мм или даже 1 мм в ткани для пациента уже является болезнью всего организма. Так как каждая его клетка – это клетка-организм, то для излечения от рака необходимо уничтожение всех раковых клеток. Но прежде надо найти каждую раковую клетку в организме среди нормальных клеток. Этого можно добиться с помощью вакцины. Рак – не одно целое, а незримое
  4. Участие гемопоэтических клеток костного мозга в процессе мета- стазирования: новые мишени диагностики метастазов раковых клеток и их уничтожения
    Причины, по которым раковые клетки могут покидать первичный очаг рака и мигрировать в другие части тела, до конца не изучены. Многие жизни можно будет спасти, если удастся останавливать этот процесс. До сих пор считалось, что место образования метастаза определяется тем, в какой орган или органы с потоком крови попадает раковая клетка или клетки из первичного очага рака. Из нее за счет деления
  5. Вакцины – основное средство поиска и уничтожения раковых клеток
    Рак – не одно целое, а расселяющиеся по всему организму пациента потомки раковой клетки-организма с образованием метастазов. Это причины того, что для уничтожения раковых клеток необходим иммунный вариант лечения, т.е. системное воздействие. Раковая клетка несет на своей наружной мембране антигены, по которым ее может распознавать иммунная система и уничтожать. Основным средством иммунного
  6. РНК-вакцина – новый способ поиска и уничтожения раковых клеток
    Стандартная лучевая терапия и химиотерапия рака не различают раковые клетки от нормальных клеток, что приводит к гибели последних. То есть оба вида лечения с тяжелыми побочными эффектами и не уничтожают все раковые клетки в организме пациента. Раковая клетка отличается от нормальной клетки наличием на своей поверхности белков-антигенов. При сравнении белков, синтезируемых раковой и нормальной
  7. Метастазирование раковых клеток: молекулярные причины и пути предотвращения
    Другим, еще более опасным следствием свойства инвазии раковых ство- ловых клеток, является образование ими метастазов в различных органах пациента. Метастаз – это вторичный очаг рака, образующийся из-за метастазирования раковых клеток в отдаленные органы. Метастазирование (от греч. metastasis – перемещение) – процесс переноса раковых клеток по кровеносным и лимфатическим сосудам из
  8. Ксеновакцина – метод профилактики возникновения раковых клеток и их уничтожения
    Термин ксеновакцина (от греч. xenos – чужой + вакцина – от лат. vaccinus – коровий) означает препарат, применяемый для профилактики и лечения, в данном случае рака. Для излечения любого типа рака необходимо уничтожение всех раковых клеток в организме пациента. Но достичь этого традиционными методами лечения – хирургия, лучевая терапия и химиотерапия – не удается, так как эти методы неадекватны
  9. Стволовые клетки – естественное средство поиска и уничтожения раковых клеток
    При раке его клетки способны проникать в окружающие здоровые ткани и распространяться по различным органам, где создают новые очаги рака – ме- тастазы. Если рак возникает из одной раковой стволовой клетки, то излечение его немыслимо без уничтожения всех его раковых стволовых клеток- потомков в организме пациента. Для уничтожения каждой раковой клетки прежде требуется ее найти среди
  10. ПЦР-ММК – метод ранней диагностики раковых клеток
    Из первой раковой клетки за счет ее деления вначале в ткани образуется узелок в 1-2 мм в диаметре. Но уже с этого размера раковые клетки индуциру- ют внутри узелка ангиогенез и лимфангиогенез. С началом оттока крови и лимфы из узелка раковые клетки отделяются от него и с кровью и лимфой раз- носятся по организму пациента – рак становится болезнью всего организма па- циента. Из этого
  11. ДНК-вакцина – новый способ поиска и уничтожения раковых клеток
    Идея использования иммунных средств для излечения от рака и попытки ее реализации принадлежат американскому хирургу У. Коли (W. Coley) и отно- сятся к концу XIX века. Однако интерес к иммунным средствам угас на многие десятилетия, так как начали применяться: хирургический метод лечения солидного рака, а позже – лучевое лечение и с 1940 г. – химиотерапия. Проф. А.Ю. Барышников (2004)
  12. Белковый чип для диагностики раковых клеток первичной опухоли и микрометастазов по сыворотке крови пациента
    Второй путь ранней диагностики раковых клеток по белкам на поверхности раковых клеток. Раковая клетка отличается от нормальной клетки того же типа по составу синтезируемых ею белков. Эти белки – продукт «поломок» в генетическом материале нормальной клетки, превратившие ее в раковую. Наличие их – признак того, что ген или гены, вызывающий перерождение нормальной клетки, начал свою
  13. ДНК-чип для диагностики раковых клеток первичной опухоли и микрометастазов по плазме крови от пациента
    Так как диссеминация раковых клеток начинается с узелка из этих клеток в 1-2 мм в диаметре, то излечение рака возможно лишь на пути его ранней диагностики. В XXI в. станут известными основные гены-маркеры и белки-маркеры, превращающие нормальную клетку в раковую. По ним будет проводиться ранняя диагностика раковых клеток. Ранняя диагностика рака – это диагностика его начала. Еще важнее
Медицинский портал "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com